ELISA實驗結(jié)果異常的因素有哪些？

ELISA運(yùn)用了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色原理，需要將抗原或抗體預(yù)包被在固相載體表面，使后來形成的抗原-抗體-酶（熒光基團(tuán)）-底物復(fù)合物黏附在載體上，通過檢測OD值或發(fā)光值，來檢測靶蛋白的含量。ELISA適合用于定量檢測胞外的分泌性蛋白，檢測大分子抗原和特異性抗體等。那么ELISA實驗結(jié)果異常的因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、樣品

樣品是檢測的前提，樣品質(zhì)量會直接影響實驗結(jié)果。可以用ELISA來檢測的樣品很多，根據(jù)檢測項目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應(yīng)避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。

血清樣品的反復(fù)凍融會使血清中的抗體效價下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內(nèi)檢測完，可4℃保存，如需長時間檢測，可進(jìn)行分裝凍存。樣品如被細(xì)菌污染腐敗，可能會導(dǎo)致假陽性。

二、溫度

溫度主要影響抗原抗體反應(yīng)，酶促反應(yīng)速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)加速，但也易引起抗原抗體復(fù)合物的解離。酶促反應(yīng)速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學(xué)活性，降低酶的有效濃度而減慢反應(yīng)速度，溫度低時以前者為主，高時以后者為主。

溫度是質(zhì)量控制的一個重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內(nèi)溫育，微孔板不應(yīng)疊置，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，盛放微孔板的濕盒應(yīng)是金屬的，傳熱容易。空濕盒應(yīng)預(yù)先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時更需要。

三、時間

在溫度保證的前提下，時間的控制至關(guān)重要，尤其是底物顯色的時間控制，顯色時間不足或過長會導(dǎo)致實驗不成立，無法對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。

加人標(biāo)本、試劑及混合的時間稱為操作時差。操作時差在每個試驗中都存在，對結(jié)果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項目，從加人第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時間差異，使抗原抗體和酶促反應(yīng)時間不一致，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。

因此，樣品過多時，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結(jié)合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時遺漏多加。

四、設(shè)備

儀器設(shè)備是ELISA實驗的基礎(chǔ)，常用的相關(guān)儀器設(shè)備包括移液器、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)和恒溫箱等。所有設(shè)備都需要進(jìn)行檢驗校準(zhǔn)，保證準(zhǔn)確性和精確度。

移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實驗誤差。

酶標(biāo)儀要提前開機(jī)預(yù)熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機(jī)要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。

恒溫箱要提前開機(jī)，開、關(guān)門要快速，保證反應(yīng)溫度。

五、顯色

顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng),此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。

在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行,時間一般不需要嚴(yán)格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延。

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