PCR純化回收的步驟與注意事項(xiàng)有哪些？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物中通常會(huì)含有過量的引物、dNTP、酶等，這些會(huì)對(duì)后續(xù)核酸序列測定、酶切、載體構(gòu)建等產(chǎn)生影響，通過PCR純化回收可獲取純的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。那么PCR純化回收的步驟與注意事項(xiàng)有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、步驟

1.在紫外投射儀或凝膠成像儀上，用刀片切取包含目的條帶的瓊脂糖凝膠并稱重；

2.一般以0.1g膠加入100μl溶膠液的比例（具體根據(jù)試劑盒說明添加），按凝膠實(shí)際重量加入溶膠液，水浴鍋中55℃溶膠（期間可緩慢震動(dòng)Ep管，將膠溶解wan全）；

3.回收試劑盒中會(huì)配有回收柱和廢液管，將溶解好的溶液加入回收柱中，并將回收柱套入2ml廢液管中；

4.12000r/min離心30-60s，去除廢液；

5.將500μl漂洗液加入回收柱，并將回收柱重新套入2ml廢液管中，12000r/min離心60-90s，去除廢液；

6.重復(fù)漂洗一次去除廢液；

7.12000r/min離心2min，將回收柱套入高壓滅菌后的1.5mlEp管中；

8.向回收柱正中央的濾膜上滴加20-30μl洗脫buffer或高壓滅菌ddH2O，靜置5-15min；

9.12000r/min離心90-120s；

10.將1.5mlEp管中的回收產(chǎn)物再次滴入到回收柱中央的濾膜上，或向?yàn)V膜中央再加10μl洗脫buffer或高壓滅菌ddH2O，繼續(xù)靜置5-15min；

11.12000r/min離心120s，1.5mlEp管中收集到的溶液即為純化回收的PCR產(chǎn)物。

二、注意事項(xiàng)

1. 切取的包含目的條帶的瓊脂糖凝膠需稱重，并按照試劑盒說明要求按比例添加溶膠液；

2. 溶膠需充分；

3. 回收管、ddH2O要提前高壓滅菌；

4. 為盡量提高回收率可以將回收產(chǎn)物再次過柱、離心。

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