細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響因素

　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響因素
 

　　做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，除了選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑，還需要對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，以便獲得轉(zhuǎn)染效果。那么你知道影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的因素有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！
 

　　一、細(xì)胞狀態(tài)
 

　　細(xì)胞狀態(tài)不好，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下，因此，轉(zhuǎn)染前要求良好的細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞活性。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度以70~90%(貼壁細(xì)胞)或2×106~4×106細(xì)胞/mL(懸浮細(xì)胞)為宜，一般不建議用生長幾天或傳代次數(shù)少的細(xì)胞做轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度過高會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)(周期進(jìn)程阻滯，凋亡增加等)，細(xì)胞密度過低可能會(huì)導(dǎo)致生長異常或者由于轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
 

　　二、質(zhì)粒
 

　　為實(shí)現(xiàn)高效率、低毒性的轉(zhuǎn)染，應(yīng)使用高質(zhì)量的質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)完整，純度高，無污染，無菌，無內(nèi)毒素。如果質(zhì)粒不純，帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細(xì)胞存在很大的毒性作用。另外抗生素一般對真核細(xì)胞無毒，但轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞通透性增加，使抗生素進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。
 

　　三、載體構(gòu)建
 

　　若質(zhì)粒基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒害作用，則轉(zhuǎn)染難以成功。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建選擇可調(diào)控，強(qiáng)度適合的啟動(dòng)子很重要，可以用空載體或相同載體的其他基因作為對照排除毒性對細(xì)胞的影響。
 

　　四、轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例
 

　　許多轉(zhuǎn)染方法都需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例。不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，細(xì)胞系的選擇通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定，轉(zhuǎn)染試劑也應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇合適的，然后進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適濃度的DNA，調(diào)整DNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例，以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。
 

　　五、轉(zhuǎn)染后篩選時(shí)間
 

　　轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷大，增殖較慢，太晚可能會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞淹沒，導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。因此一般是在轉(zhuǎn)染48h之后開始加抗生素篩選。
 

　　六、污染
 

　　細(xì)胞污染會(huì)造成轉(zhuǎn)染效率低下，為防止細(xì)胞污染應(yīng)注意避免培養(yǎng)物被細(xì)菌、真菌、病毒、支原體或其他細(xì)胞種類等污染；避免培養(yǎng)的細(xì)胞被支原體污染，必要時(shí)進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查；避免與實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)的其他種類細(xì)胞發(fā)生交叉污染。
 

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