DNA 結(jié)合蛋白的凝膠阻滯分析實驗

材料與儀器

作為對照的核提取物或蛋白組分 核提取物或蛋白組分
Ficoll 400 聚乙烯醇 蔗糖染色液 10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液 4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝膠 poly(dI-dC) 32P標記的對照DNA 32P標記的靶DNA
雜交膜

步驟

材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組成請參見附錄1。
貯存液需稀釋到適當濃度。
Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll溶解在無菌水中，分裝成100ul并凍存在-20°C。
聚乙烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在無菌水中, 分裝成100ul并凍存在-20°C。
蔗糖染色液
0.25%(m/V)溴酚蘭
0.25%(m/V)二甲苯青
40%(m/V)蔗耱（葡萄糖）
溶解于水，用0.22um濾器過濾；貯存于室溫或4°C。
10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液
凝膠
4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝膠（厚度≤1.5 mm)
核酸和寡核苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
適量poly(dI-dC)溶于無菌水中，每管分裝100ul并凍存在-20°C。關(guān)于poly(dI-dC)在凝膠阻滯試驗中的作用的更多信息請見信患欄poly(dI-dC)部分。

放射性化合物
32P標記的對照DNA
32P標記的靶DNA>20bp[比活性≥2.5x107cpm/噸（≥5000cpm/fmol)]
DNA 片段標記可以通過磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶補平 3'-退縮末端（第 9 章方案 10, 或第 10 章方案 7); 或用 PCK 方法使帶放射標記的核苷酸播到探針中（第 8 章方案 1)。最后一種方法最快，提供的探針比活性也最高有關(guān)怎樣標記 DNA 探針的建議，請見本方案末尾的欄目：疑難解析及凝膠阻滯分析試驗的優(yōu)化。
特殊設(shè)備
雜交膜
細胞和組織
作為對照的核提取物或蛋白組分
核提取物或蛋白組分
用方案 1 中介紹的任意一種方法制備提取物。在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物或麥胚提取物中進行體外翻譯得到的蛋白也可以用來作為 DNA 結(jié)合蛋白。如果是后一種情況，通常用 1~20ul 蛋白來替代核提取物。
方法
1. 在無菌的 1.5 ml 離心管中加入:
32P 標記的靶 DNA 1ng(1~10fmol)
1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul
核提取物（5~10ug） ≤10ul
或者
蛋白組分 ≤10ul
20%Ficoll 400 5ul
或者
10% 聚乙烯醇 4ul
H2O 加到 20ul
2. 反應(yīng)管離心幾秒鐘使反應(yīng)混合物沉到管底。冰浴 10~30 min。

3. 每管加入 3ul 蔗糖染色液。樣品加到 4%~7% 中性聚丙稀酰胺凝膠中。

4. 在 0.5XTris-甘氨酸緩沖液或 0.5XTBE 緩沖液中跑膠，200~250V,20mA,≥2 h。
根據(jù)結(jié)合蛋白的不穩(wěn)定性和結(jié)合反應(yīng)的親和性，有時候可能需要在 4°C 跑膠。

5. 電泳完成后，撬開凝膠板，把凝膠轉(zhuǎn)到一片結(jié)實的雜交膜上，在干膠機上干膠約 1 h。

6. 用干膠對 X 射線膠片在-20°C 曝光≥1h, 使放射標記的 DNA 片段顯現(xiàn)出來。豐度低一些的 DNA-蛋白復(fù)合物用磷屏圖像分析大約 1~3 h 就可以檢測到。