RNA 的提取和純化實驗

材料與儀器

1. 緩沖液、溶液和試劑
氯仿
焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的 H20(GenHimterR105)
乙醇
70% 乙醇洗液（用 DEPC 處理過的 H20 配制）
異丙醇
苯酚-胍鹽單相溶液（推薦 RNApure,GenHunterP501-P503)
磷酸鹽緩沖液（PBS)
2. 離心機和轉(zhuǎn)頭
小離心機
3. 專用設(shè)備
50 ml 錐形管
1.5 ml 小離心管
1000ul(原文為 ml。—譯者改）移液器
100~150 mm 平板
P10 移液器
Pdytron 勻漿器（用于從組織中提取 RNA)

步驟

一、RNA 提取
方法 1: 從組織培養(yǎng)物中提取 RNA
1. 如果細胞貼在瓶壁或平板上，則倒掉培養(yǎng)基，將平板置于冰上。
2. 如果細胞是懸浮的，旋轉(zhuǎn)離下細胞，并除去培養(yǎng)基。
3. 用 10~20 ml 的冷磷酸鹽緩沖液（PBS) 漂洗細胞。
4. 倒掉 PBS，并用 1000ul 移液器吸去殘留的 PBS。
5. 每 100~150 mm 平板加入 2 ml 苯酚-胍鹽單相溶液（RNApure)，以裂解細胞（搖晃平板使溶液分布均勻）。這個體積足夠裂解 100 萬~1000 萬個細胞。
6. 將平板放在冰上 10 min。
7. 將裂解液吸到兩個標記好的 1.5 ml 離心管中。
方法 2: 從組織中提取 RNA
1. 在裝有組織的 50 ml 錐形管中，加入至少 2 ml 苯酚-胍鹽單相溶液（RNApure), 并置于冰上。組織和酚溶液的理想比例至少應(yīng)該是 1:10。
2. 用 Polytron 勻漿器將組織攪勻，直到組織wan全分散為止。
3. 將管子置于冰上10min。
4. 取 1ml 裂解液，分裝到標記好的 1.5 ml 離心管中。
方法 3: 從血液中提取 RNA
1. 將血液產(chǎn)品離心，并除去血漿。
2. 按照上面從組織中提取 RNA 的說明逬行操作。

二、RNA 的純化
1. 每毫升裂解液加入 150ul 氯仿，渦旋混勻 10min。
本方案可以在此處停止，并將裂解液放置在-80°C
2. 在 4°C 以最大轉(zhuǎn)速離心 10min。
3. 小心地將上清液轉(zhuǎn)移到一個干凈的、標記好的 1.5 ml 離心管中。
4. 加入等體積的異丙醇，并在冰上放置 10min，然后劇烈地混勻或渦旋混勻 30s。
5. 將混合物在 4°C 以最大轉(zhuǎn)速離心 10min。
6. 用 1ml 預(yù)冷的 70% 乙醇（用 DEPC 處理過的 H20 配制）洗滌 RNA 沉淀，在 4°C最大轉(zhuǎn)速離心 2 min。
7. 倒掉乙醇。短暫離心后，用移液器吸去殘留的洗液。
8. 將 RNA 在 5ulDEPC 處理過的 H20 中重新懸浮。
注意：如果 RNA 用于任何擴增反應(yīng)，懸浮液中不要使用 SDS。
9. 取1ul RNA(用 P10 移液器）測定濃度，用1ml H20 稀釋。在 260nm 下讀數(shù)，注意 1OD260=40ug。

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