貼壁細(xì)胞傳代操作步驟

一、細(xì)胞傳代

細(xì)胞傳代培養(yǎng)是指將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶中移植到下一個培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)和增殖的過程。傳代培養(yǎng)的目的是實現(xiàn)細(xì)胞擴(kuò)增，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。一般細(xì)胞可傳代10-50代。

指數(shù)生長期是細(xì)胞活力best的時期，可對細(xì)胞進(jìn)行各種實驗。細(xì)胞生長一段時間后會呈現(xiàn)接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象。癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制。細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，pH值下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時應(yīng)及時進(jìn)行傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。

二、貼壁細(xì)胞傳代操作步驟

1）將培養(yǎng)基、胰酶及PBS等預(yù)先在37℃水浴中加熱30分鐘；

2）從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時即可進(jìn)行傳代；

3）將培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液吸除或傾倒，使用PBS清洗瓶內(nèi)殘留培養(yǎng)基，并倒盡；

4）向瓶內(nèi)加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液，確保其能覆蓋培養(yǎng)瓶底部，T25瓶約需1ml，T75瓶約需1-2ml；

5）將培養(yǎng)瓶置于37℃孵箱或室溫（25℃）下進(jìn)行消化，觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞wanquan變圓且輕輕敲打瓶身時有部分細(xì)胞脫落為準(zhǔn)。一般情況下，細(xì)胞消化過程持續(xù)1-2分鐘即可完成；

6）直接添加適量含血清的培養(yǎng)基以終止消化，T25瓶可加入2ml或以上，T75瓶可加入3ml或以上；

7）使用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序輕柔地吹打瓶壁，使細(xì)胞從瓶壁上脫落；

8）對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取25μl細(xì)胞懸液、65μl PBS與10μl臺盼藍(lán)混合均勻后，取10μl置于計數(shù)板中，使用顯微鏡進(jìn)行計數(shù)，以判斷細(xì)胞濃度；

9）根據(jù)細(xì)胞濃度進(jìn)行細(xì)胞分瓶培養(yǎng)。一般按照1：2至1：8的比例進(jìn)行傳代，將細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。具體傳代比例需依據(jù)細(xì)胞量而定，傳代過稀會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，傳代過密則可能引起接觸抑制或密度抑制等問題，影響細(xì)胞生長；

10）細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液的時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實驗需求而定，一般建議在2至3天后更換培養(yǎng)液。

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