碧云天活性氧檢測試劑盒說明書

一、產(chǎn)品簡介

活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也稱ROS Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。

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本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物(compound mixture),濃度為50mg/ml。使用本試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧的效果請參考圖1。
圖1. 碧云天活性氧檢測試劑盒(S0033)檢測L929 (小鼠成纖維細胞)細胞內(nèi)活性氧的效果圖。L929細胞裝載DCFH-DA探針后用50μg/ml Rosup處理30分鐘，隨后PBS洗滌一次后用熒光顯微鏡(圖A)檢測。正常的L929細胞中探針幾乎未被氧化成熒光化合物，細胞中的綠色熒光非常弱；使用活性氧陽性對照試劑Rosup處理使細胞內(nèi)活性氧生成大幅增加，DCFH-DA與活性氧反應(yīng)，細胞中的綠色熒光顯著增強。實際結(jié)果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中效果僅供參考。
本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。
本試劑盒S0033S包裝可以測定100-500個樣品，S0033M包裝可以測定500-2500個樣品。

包裝清單：

二、保存條件：
-20℃保存，一年有效。
三、注意事項：
探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。
探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考下頁圖譜。
盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外)，以減少各種可能的誤差。
熒光酶標(biāo)儀檢測時須使用適合熒光檢測的黑板或白板，推薦使用碧云天BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔細胞培養(yǎng)板(平底帶蓋, 獨立包裝) (FCP965)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

四、使用說明：
1. 裝載探針
對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1:1000用細胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS等適當(dāng)溶液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37oC細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用細胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS、無血清細胞培養(yǎng)液等適當(dāng)溶液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細胞后裝載探針：按照1:1000用細胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS等適當(dāng)溶液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37oC細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用細胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS、無血清細胞培養(yǎng)液等適當(dāng)溶液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。細胞外液推薦使用細胞外液(Extracellular Solution) (C0216)，PBS推薦使用PBS (C0221A)，HBSS推薦使用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218)。
2. 檢測
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3. 參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

4. 其它說明
陽性對照Rosup可以按照1:1000的比例酌情使用PBS、HBSS、細胞外液或無血清培養(yǎng)液稀釋后使用。例如裝載好探針的細胞，直接吸除液體或離心后吸除液體，加入適當(dāng)體積的按照1:1000稀釋的Rosup陽性對照刺激。通常刺激后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。Rosup對不同細胞的效果會有所不同。
另外，對于某些細胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。
探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進行調(diào)整。
活性氧陽性對照(Rosup)僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

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