PCR技術的基本原理、各步驟的目的是什么？

你知道PCR技術的基本原理、各步驟的目的是什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、PCR技術基本原理

PCR是一種選擇性體外快速擴增DNA片段的方法。在體外以類似于細胞內DNA的半保留復制過程，以擬擴增的模板DNA分子，與模板DNA互補的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應體系，經過重復地變性一退火一延伸三步，擴增新的目的DNA鏈，這個過程通過控制反應體系的溫度來實現。

PCR包含下列三步反應：

1、變性(denaturation)

將反應體系混合物經加熱至94℃左右，維持較短的時間，使雙鏈DNA變成單鏈DNA，便于下一步引物的結合。

2、退火(annealing)

將反應體系溫度下降到特定溫度（一般是引物的Tm值以下)，引物與DNA模板以堿基互補的方式結合，形成模板-引物雜交雙鏈。退火溫度是保證引物與DNA模板互補結合的關鍵。由于引物結構簡單，加之引物量遠遠大于模板DNA的數量，所以DNA模板單鏈之間的互補結合很少。

3、延伸(elongation)

將反應體系的溫度上升到72℃左右并維持一段時間，在Taq DNA聚合酶的作用下，以引物為起始點，以4種單核苷酸（dNTP）為底物，從5'→3'方向延伸反應，合成新的DNA雙鏈。

以上三步反應為一個循環，重復進行變性、退火、延伸這三步反應，如此反復循環可以使DNA以指數形式進行擴增。上述過程1.5小時左右完成，從而使所需的目的DNA片段擴增放大百萬倍。

二、PCR各步驟目的

1、預變性

破壞DNA中可能存在較難破壞的二級結構。使DNA充分變性，減少DNA復雜結構對擴增的影響，以利于引物更好地和模板結合，特別是對于基因組來源的DNA模板，最好不要省去這個步驟。此外，在一些使用熱啟動Taq酶的反應中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應得以順利進行。

2、變性一退火一延伸循環

(1)模板DNA的變性

模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙徒DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備。

(2)模板DNA與引物的退火（復性）

模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。

(3)引物的延伸

DNA模板—引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

3、PCR儀擴增循環后72℃延伸10分鐘

用PCR儀擴增時，變性一退火一延伸循環完成后，繼續72℃延伸10分鐘的原因是：

(1)在反應體系一定的條件下，延伸時間取決于待擴增DNA片段的長度。例如，使用Taq DNA聚合酶，72℃時的堿基摻入率為35~100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。

(2)根據延伸速率推得，擴增1kb以內的DNA片段1分鐘即可，而3~4kb則需要3~4分鐘，依次類推。通常，在最后一輪要適當地將延伸時間延長至4~10分鐘，這樣做是使PCR反應wan全以提高擴增產量。

(3)繼續72℃延伸10分鐘除了可以使PCR反應wan全以提高擴增產量外，還有一個作用是：在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進行。

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