原代細胞如何獲取？

原代細胞(primary cell)：是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養的細胞，稱為原代細胞。一般認為，培養的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。

原代細胞的獲取難度大、需要考慮的問題多，原代細胞如何獲取？

原代細胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個細胞再進行培養的過程，且整個過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有：組織分解的方式，培養的時間，換液時間，細胞狀態判斷和凍存。

一、組織分解的方式

將組織分解成單個細胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對貼壁細胞）。

1. 酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。

 膠原酶的選擇：（根據自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實驗成功的大前提。）

膠原酶的配制：常用的是DMEM進行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內預熱（注意現用現配）。

膠原酶消化時間：根據組織特性，消化時間會有差異。以小鼠腎細胞為例，加入膠原酶Ⅰ進行消化后，放入37℃培養箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎wan全消失為止（若是組織塊剪得非常細小，時間可以短一些，30min左右即可）。

培養過程：注意原代細胞在培養2天后可能會出現細胞液變黃（橘黃色）的現象，且無漂浮物，這是正常現象哦，不是污染。這是由于細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2和其他物質導致培養液PH發生了改變，所以變黃。

2. 組織塊法

取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm²），清洗干凈后轉移至培養皿中，在培養皿中各組織塊要排列均勻。 

加液：培養液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養4h左右加培養液，培養48h后換液。

二、培養時間

無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養時間最少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。

三、換液時間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養期間需要隨時關注細胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

四、細胞狀態判斷

正常貼壁細胞在培養幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。這些細胞的狀態比較好，生長至80%~90%融合就可以傳代啦，傳代一次后的細胞會更干凈漂亮。

五、凍存

傳一代后的細胞（也可以不傳代直接凍存）培養至80%~90%便可凍存起來供后續實驗用。

凍存液配制：不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案，各實驗室也有自己的凍存方案，

常見的方案有：

a: 10%DMSO+90%的FBS；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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