免疫印跡膜（PVDF膜）的知識分享

一、免疫印跡膜的介紹

在Western blotting實驗中，NC膜和PVDF膜是最chang用的兩種膜。NC膜是特異性轉移介質之一，使用范圍十分廣泛，也是最早用于Western blotting實驗的膜。PVDF膜是在1985年開發(fā)出來的，它能在比較苛刻的條件下(比如在酸性或堿性條件下，或者在有機溶劑存在時)將蛋白保留，因此更廣泛用于Western blotting實驗中。

二、作用機理的介紹

1.  NC膜

NC膜與蛋白質之間是依靠靜電作用和疏水作用相結合的，NC膜屬于親水膜，使用前無需進行預活化，使用方便、價格低廉、對蛋白質的活性影響小、背景低；但其韌性較差，易損壞，從而不能反復使用，如果在非離子型去污劑作用下，結合上的蛋白比較容易被洗脫下來。

2.  PVDF膜

PVDF膜與蛋白質之間是依靠疏水作用相結合的，與NC膜相比，PVDF膜有著ji好的化學穩(wěn)定性和更高的機械強度，適合反復檢測（reprobing）和多次剝離（stripping）。PVDF膜需要先用甲醇潤濕后才能被常規(guī)的轉膜液所浸潤，轉印緩沖液中添加的Ca2+離子能夠增強鈣調蛋白與Immobilon®-P轉印膜的結合，鈣的結合使蛋白質分子形成一個疏水袋結構，從而增加蛋白與膜的結合。此外，PVDF膜具有更高的蛋白結合能力，一般NC膜的結合能力是80-100μg/cm2，而PVDF膜可以達到150-160μg/cm2。因此，PVDF膜已成為現(xiàn)階段實驗室WB的常用膜。

三、PVDF膜使用須知

1. PVDF膜為什么需預先活化？

PVDF膜本質上是一種疏水性的聚合物，不帶電荷并具有疏水性，不能被常規(guī)轉膜液所浸潤，為了在水性緩沖液中使用，需要在使用前進行預處理以浸潤和活化膜。最chang用的方法是使用50%（v/v）或更高濃度的醇（甲醇、乙醇和異丙醇）溶液進行浸潤和活化，使得PVDF膜中微孔內的空氣能夠被低表面張力的甲醇所替代，從而易于后續(xù)緩沖液進入PVDF膜中的微孔內，使得PVDF膜從疏水性轉變?yōu)橛H水性，在浸潤過程中膜的外觀會從不透明轉變?yōu)榘胪该鳎藭r表明PVDF膜已被wan全浸濕。然后用水反復沖洗以去除醇類，再直接將膜放入轉印緩沖液中進行平衡。膜被浸濕后，通過電轉移，蛋白質與膜接觸發(fā)生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。

2. PVDF膜孔徑對蛋白結合的影響？

膜孔徑越小，膜對低分子量的蛋白結合就越牢固。首先，較小的孔徑會限制蛋白分子的運動，減緩其轉移速度，蛋白與膜的結合就更充分，從而更容易被攔截在孔道內；其次，較小的孔徑還能提供較大的膜表面積，從而提高了蛋白與膜接觸的機會；此外，較小的孔徑也能提供更高的表面密度，從而增加了孔道與溶液間的分子間吸引力，這種吸附方式被稱為“毛細作用"。Schweitzer和Kriz在一項研究中發(fā)現(xiàn)，較小的孔徑可以增強其吸附能力并提供更高的蛋白密度，蛋白分子量越低，蛋白的比表面積越大，與膜接觸面越大越充分，結合就更緊密。但是，如果膜的孔徑小于0.1 μm，那么蛋白的轉移就很難進行下去了，是因為蛋白質分子的直徑大約在1-100 nm之間。

3. 如何選擇PVDF膜？

一般情況下，分子量大于20kD的蛋白應選擇0.45μm的膜，分子量小于20kD的蛋白應選擇0.2μm的膜。0.2μm的PVDF膜內部表面積大約是0.45μm的PVDF膜的三倍，因此其吸附能力更高。總之，選擇PVDF膜的孔徑大小需要根據(jù)樣品蛋白的特性和大小來確定，以期獲得最佳的結合效果。

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